菌P解特究震荡培养箱中(300C
(5)菌株接种浓度及培养基初始黄曲霉毒素B1浓度对降解效果的浑浊红球黄曲影响
菌株接种浓度及培养基初始AFB1浓度对降解效果的影响实验参考LinZhao等方法并作适当修改。取浑浊红球菌PD630菌种接种于NB培养基,菌P解特究震荡培养箱中(300C,对的生160r/min)活化36h后得到PD630菌株活化液,霉毒调整0D600控为1.5。物降菌液按照10%接种量接种于含AFB1的性研无菌培养基中,AFB1终浓度为0.4μg/mL。浑浊红球黄曲无菌NB培养基代替PD630菌液作为空白对照。菌P解特究分别在培养0、对的生12、霉毒24、物降36、性研48、浑浊红球黄曲60和72h后提取样品中的菌P解特究AFB1,HPLC测定培养基中AFB1残余浓度,对的生分别接种1%、5%、10%、15%菌液于含AFB1的无菌NB培养基中,使AFB1终浓度为0.4μg/mL,无菌NB培养基作为空白对照。调整NB培养基中的AFB1使终浓度分别为0.25、0.5、1.0、2.0ug/mL,按10%接种量加入菌株活化液,以AFB1终浓度相同的无菌NB培养基作为空白对照。震荡培养箱培养(300C,160r/min),分别于0、12、24、36、48、60和72h取样,提取培养液中残留的AFB1进行HPLC分析。
(6)无细胞上清、菌细胞悬液、胞内裂解物对黄曲霉毒素B1的降解活性
PD630菌株在300C,160r/min条件下培养72h,菌株发酵液通过在40C,8000r/min离心20min收集上清及细胞沉淀物:(a)上清液通过0.22μm无菌滤膜过滤后用于进一步实验;(b)菌体细胞沉淀用无菌生理盐水洗涤3次后再次用生,理盐水重悬,制备得到菌细胞悬液;(c)取部分菌悬液通过细胞超声破碎仪破碎后,细胞内容物在8000r/min,40C离心20min,0.22μm滤膜过滤得到胞内裂解液;(d)取部分发酵液不作任何处理;(e)灭菌备用的NB培养基。
在上述所制备的5种处理液中分别加入AFB1,终浓度为0.4μg/mL。将培养体系置于300C,180r/min黑暗温育72h后,提取AFB1进行HPLC分析。
(7)PD630菌株无细胞上清对黄曲霉毒素B1的降解效果,按PD630菌株在300C,160r/min条件下培养72h,菌株发酵液通过在40C,8000r/min离心20min收集上清及细胞沉淀物:(a)上清液通过0.22μm无菌滤膜过滤后用于进一步实验;(b)菌体细胞沉淀用无菌生理盐水洗涤3次后再次用生,理盐水重悬,制备得到菌细胞悬液;(c)取部分菌悬液通过细胞超声破碎仪破碎后,细胞内容物在8000r/min,40C离心20min,0.22μm滤膜过滤得到胞内裂解液;(d)取部分发酵液不作任何处理;(e)灭菌备用的NB培养基。在上述所制备的5种处理液中分别加入AFB1,终浓度为0.4μg/mL。将培养体系置于300C,180r/min黑暗温育72h后,提取AFB1进行HPLC分析。加入AFB1使终浓度为0.4μg/mL,在300C,180r/min的黑暗条件下培育,分别在0、12、24、36、48、60、72h取样分析AFB1残留量。AFB1终浓度相同的无菌NB培养基作为空白对照。
(8)加热、EDTA、蛋白酶K对无细胞上清降解黄曲霉毒素B1活性的影响
根据XiulanSun等方法进行研究。为了探究无细胞上清中的活性成分性质,分别沸水浴处理20min;1210C高压灭菌锅处理10min;0.1MEDTA处理lh;1mg/mL蛋白酶K在550C下处理lh。处理结束后在各处理上清液中加入AFB1,令AFB1终浓度为0.4ug/mL,在300C,180r/min的培养条件下黑暗温育72h。AFB1终浓度相同的无菌NB培养基作为空白对照,温育结束后提取AFB1进行HPLC分析。
4、数据处理
采用Originpro2018和SPSS23.0对本文数据进行处理和分析,每组重复3次。
二、结果与讨论
1、黄曲霉毒素B1的提取及测定,通过:
①高效液相色谱法色谱条件
色谱柱:WatersC18柱(5μm,4.6x150mm);流动相为乙腈:水=40:60(v/v);流速:1.0mL/min;柱温:300C;进样量20uL;检测器:紫外检测器;检测波长365nm。
②黄曲霉毒素B1标准曲线的制作及样品的处理标准
曲线的制作:将lmgAFB1标准品溶解于25mL色谱级甲醇中,得到40μug/mL标准储备液,保存于-200C冰箱中。将该储备液用色谱级甲醇精密稀释,获得0.5、1、2、4、8μg/mL的标准曲线工作溶液。色谱柱:WatersC18柱(5μm,4.6x150mm);流动相为乙腈:水=40:60(v/v);流速:1.0mL/min;柱温:300C;进样量20uL;检测器:紫外检测器;检测波长365nm。按色谱条件进行HPLC分析,以溶液浓度为横坐标,色谱峰面积为纵坐标,绘制AFB1标准曲线,计算得到回归方程为:y=74752x—4894.6,R2=0.9998的实验所述的高效液相色谱法测定得到黄曲霉毒素B1色谱图。
由图1可知,该高效液相色谱法对AFB1有良好的分离测定效果,AFB1在紫外波长为365nm的条件下出峰良好,峰形符合液相要求,出峰时间为3.8土0.5min。
2、添加标准品分析黄曲霉毒素B1提取测定方法回收率及精密度
依据方法学对黄曲霉毒素B1的提取测定方法进行了评估,以保证AFB1结果测定的可靠性。
AFBI分析方法的回收率及精密度如表1所示。
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